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【科学普及】间充质干细胞治疗(二):先进制造工艺

发布时间:2022-11-30 02:45:08

来源:爱游戏应用下载
商品说明

  书接上回,上一期我们简述了间充质干细胞的研发历程,从国际视野角度介绍了全球间充质干细胞药物研发现状,指出了干细胞药物开发面临的困难。

  如果要开发一种“现货型”异体间充质干细胞疗法,规模化生产是阻碍其成药的一个重要因素。本期,我们将浅谈一下间充质干细胞的生产工艺。

  1976年,Freidenstein 等[1]首次发现在骨髓里存在一群非造血的骨髓基质细胞,呈克隆性贴壁生长,形态和成纤维细胞相似。最初被定义为成纤维细胞集落形成单位,之后更名为间充质干/基质细胞 (Mesenchymal Stem/Stromal cell,MSCs)。如今,MSCs 已从人类许多其他来源组织中分离和鉴定出来,广泛分布于几乎所有组织(包括胎儿和成人),例如骨髓、血液、脐带、脐血、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、经血等等。

  目前,国际获批上市的 MSCs 产品近10种。随着大家对 MSCs 治疗效果的逐步认可和观点的逐步改变,在不久的将来,将可能有更多 MSCs 产品将获批。有一篇报告[3]描述,细胞产品大概分三种剂量:低剂量(2X10*6 /剂),中剂量(1X10*8 /剂)、高剂量(1.5X10*9 /剂)。

  目前,临床使用的 MSCs 种类各不相同,来源于不同组织(包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪等)。虽然不同组织来源的 MSCs 均能符合国际细胞治疗协会(ISCT)制定的最低标准,但依然有不少研究的结果提示不同组织来源的MSCs 具有某些差异性(比如细胞大小、增殖潜能、分泌细胞因子种类和数量,免疫抑制能力也不尽相同)。

  面对不同的适应症,我们可能会采用不同组织来源的 MSCs 产品进行治疗。然而,采用不同的细胞分离技术,获得的细胞质量可能千差万别(比如脐带血、骨髓来源的MSCs主要是密度梯度离心法,脂肪和脐带来源的MSCs主要靠酶消化法)。因此,选择合适的分离技术是获得相对可靠、安全、高质量初代 MSCs 的关键。

  如何选择合适的 MSCs 生产制造工艺,主要取决于两点:一是细胞剂量的要求,二是自体还是异体使用。

  目前,间充质干细胞制备技术分为两大类,包括平皿制造工艺和生物反应器制造工艺。利用自体细胞来源的 MSCs 进行个体化治疗,属于小规模生产,各自企业的标准和工艺也不尽相同。异体细胞来源的 MSCs 规模化制造工艺是利用生物反应器,模拟其在体内的生长发育环境,进行高效率增殖。同时,可以满足自动化、量产并能保证细胞的高活率和高质量的要求,这也是今后各种干细胞规模化生产的发展趋势。

  中小规模的临床试验通常使用平皿制造工艺,包括多层平皿培养体系,也称“细胞工厂”(大约8-10层平皿,主要有Thermo Scientific、BD和Millipore等品牌),可以扩增出100亿(10*10)个细胞,相对经济有效。

  事实上,在 Osiris Therapeutics 公司进行的早期临床试验中[5]就声称,只需一份捐献的骨髓,便可制备多达10000份患者的剂量,用于治疗GVHD。他们的细胞制备,使用的平皿制造工艺。从成本上来看,平皿制备工艺比较经济。但是质控比较麻烦,需要的人工也多,同时也容易引入外来操作风险。

  比起人工手动操作,自动化平皿制造工艺略有进步,也具有在线监控功能,可以实现封闭式培养。例如,Xpansion Multiplate 便是自动化平皿培养的一种设备,由一堆平板(10-200层)组成,具有可扩展性[6]。据制造商[6]声称,这种200块平板组成的系统一次开机,可生产200亿(2X10*10)个细胞,但生产下游不好处理。如果剂量处于100-1000亿(1-10X10*10)个细胞之间,平皿制备工艺可以满足MSCs的生产需求,但通常需要堆叠40层。这就需要更大的空间和自动处理装置。

  平皿制备工艺,无法满足规模化的细胞生产需求(大于300亿,即3X10*10细胞),这时候就需要引进新的工艺体系。比如,下面要介绍的生物反应器制备体系。

  生物反应器制备工艺,可作为体外培养的平皿制备工艺替代品。生物反应器,通常对细胞最小接种量是有要求的。早期的 MSCs 扩增,通常先是在平皿中手工操作进行,随后再被接种到生物反应器中。简单的搅拌容器,比平皿更有优势,不但具有可扩展性,还可以提供均匀的最低浓度梯度(pH,溶解氧,代谢物)。如果细胞与微载体结合培养时,可在搅拌条件下固定并培养贴壁细胞,这无疑是最有效技术之一。

  在这里,介绍两大类生物反应器类型:灌注式生物反应器(包含中空纤维生物反应器 )与搅拌悬浮式生物反应器。

  灌注式生物反应器,是一种将MSCs附着在固定基质上的系统(如微珠),可连续交换介质,在排出介质的同时引入新鲜介质。灌注生物反应器由几组平行板、中空纤维、固定床和流化床生物反应器组成。

  灌注式生物反应器为细胞生长提供了一个连续的表面积,MSCs可单层附着在填充床表面上,但必须在低流速下灌注(通常不超过3X10-4m/s),使细胞剪切力最小,但这也会导致向细胞输送的氧气减少。通过解耦营养和氧灌注的策略,可以限制培养基的流动而不影响氧向细胞的扩散。一般而言,填充床反应器的细胞获得率通常相对较低(18%),产量限制在约1亿(10*8)个细胞。

  中空纤维生物反应器,也属于灌注式生物反应器的一种。它由一个容器和堆叠的半透性中空纤维组成,可以允许细胞生长在中空纤维毛细管的一个表面,而营养液和氧气在另一个表面流动。其扩增效率大约是平皿制备体系的10倍(按照培养UC-MSCs计算)。

  中空纤维生物反应器,每一次运行可生产4~6亿(10^8)数量的MSCs,具有典型的商业特性。如果要开展临床试验需要供应足够的MSCs,那么则需要多个生物反应器才能实现。

  搅拌悬浮式生物反应器,主要用于MSCs的大规模生产。以旋转瓶为原型,用搅拌臂将培养基在培养瓶中搅拌混匀。

  在搅拌悬浮式生物反应器中,MSCs通常附着在悬浮在搅拌容器中的微载体上。这类生物反应器可以产生多达5000亿(50X10*10)个细胞(此类产品有Eppendorf、Thermo Scientific和PALL等品牌,国内华龛生物自主研发的3D FloTrix®vivaSpin 系列也属于此类)。其范围从小体量(3-250ml,适合工艺参数测试)到台式规模(1.5-5L),再到中式规模(50-300L),最后到生产规模(500-2000L)。工艺下游的处理需要连续离心,自动袋或小瓶填充等完成。

  说到搅拌悬浮式生物反应器,这里必须要讲一下微载体(有SoloHill®,CultiSpher®-S,Cytodex®-1等品牌,国内自主研发品牌华龛生物3D TableTrix®)。微载体是干细胞赖以附着生长和扩增的基质。微载体可以用各种材料(聚苯乙烯、纤维素、葡聚糖、玻璃、海藻酸盐和明胶等)制备;可以为无孔,微孔,大孔;可以有表面涂层(胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和多聚赖氨酸等),也可以没有。

  简单的说,如果说生物反应器是一个海洋,那微载体就是一个个岛屿,而干细胞就是居住在这些岛屿上的居民。干细胞可以在微载体上的有效扩增和分化,依赖其调节细胞形状和形成组织的能力。由于微载体具有多样性,利用特定微载体的合理设计,可能为规模化细胞制备提供均一稳定的制剂来源。

  但微载体缺点也很明显,比如微载体容易聚团,高速旋转产生的剪切应力会对细胞造成损伤,微载体和干细胞的分离也是个难题。

  本期内容,我们简单介绍了间充质干细胞的生产工艺,包括平皿制造工艺和生物反应器制造工艺。开发者可以根据 MSCs 细胞药物的自身特性(如自体/异体,剂量,剂型,规模),选择合适的生产工艺。

  作为细胞产品,必须确保进入临床的每一剂细胞质量都是可靠的。有效的质量控制方法和标准,是干细胞临床安全性和有效性的基础和前提。先进的生产工艺有选择了,那么我们如何能保证细胞产品的质量呢(比如:无菌性,安全性,活力,均一性,纯度,稳定性和效力)。下一期,我们将针对间充质干细胞的质控体系展开论述,敬请期待!



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